液相色谱（High Performance Liquid Chromatography）是近年来发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的快速分离分析技术。它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，灵活多样。液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的问题，如果了解一些日常使用和维护注意事项，就能做到早预防、勤维护，使分析结果保持较好的稳定性与较高的性。 

　　一、流动相 

　　1.流动相的性质要求 

　　液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下特点： 

　　1.1流动相应不改变填料的性质。 

　　1.2纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，溶剂所含杂质在柱上积累，影响色谱柱的使用寿命。流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质（使用0.45um或更细的膜过滤）。 

　　1.3流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。比如使用紫外检测器时，所用的流动相在检测波长下应没有吸收或吸收很小，溶剂中如果有吸收紫外光的物质，会使检测背景提高，灵敏度降低，且用作梯度洗脱时会引起严重漂移。。 

　　1.4对样品的溶解度要适宜。流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。 

　　1.5流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 

　　2.流动相的PH值 

　　流动相的pH 值应控制在2～8 之间。当pH 值大于8 时，可使载体硅胶溶解；当pH 值小于2 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。 

　　3.流动相的脱气 

　　HPLC所用的流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相反应，一般采用超声脱气。 

　　4.流动相的过滤 

　　所用溶剂使用前必须经0.45um滤膜滤过，以除去杂质微粒。用滤膜过滤时，注意分清有机相和水相滤膜。且勿混用，有机相滤膜过水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜过有机溶剂时，滤膜会被溶解。严禁溶有滤膜的溶剂用于液相色谱分析中。 

　　5.流动相的贮存 

　　流动相一般贮存于玻璃或不锈钢容器内，不能贮存于塑料容器内。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器内一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化。也防氧和二氧化碳溶入溶剂。应尽量新鲜配制使用，不要贮存。 

　　6.实验用水 

　　实验用水应为超纯水，并通过滤膜过滤。 

　　二、色谱柱 

　　液相色谱法对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。所以说色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，要注意下列问题，以维护色谱柱。 

　　1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况。因此在安装时要轻拿轻放。 

　　2.色谱柱的使用方向 色谱柱所示方向是评价流动相流动方向。不可以反冲会迅速降低柱效。 

　　3.色谱柱PH使用范围是2.0-9.0。当使用PH值范围边界时，分析结束立即用与所使用流动相互溶的溶剂*清洗置换流动相。 

　　4.避免将基质复杂的样品尤其生物样品直接注入柱内，是用预处理柱。 

　　5.每次分析结束后，都要对色谱柱进行冲洗。每次工作完后，用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。 

　　6.若长时间不用该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存。 

　　三、泵的使用和维护注意事项 

　　为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，应按以下注意事项进行操作： 

　　1.防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环等，泵的入口应经常清洗或更换。 

　　2.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内。尤其是在停泵过长时间情况下。由于溶液静置，就可能析出盐的微细晶体。同样会损坏密封环、柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗。再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂。 

　　3.要防止溶剂瓶内的流动相用完，空泵运转会磨损柱塞或密封环，zui终产生漏液。 

　　4.压力不要超过规定的zui高压力，否则会使高压密封环变形漏液。 

　　5.流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量的气泡，泵就无法正常工作。 

　　四、检测器的维护 

　　作为液相色谱仪的三大关键部件（输液泵、色谱柱、检测器）之一的检测器，主要用于监测经色谱柱分离后的组分浓度的变化，将样品组成和含量变化转化为可供检测的信号，完成定性、定量分析。常用的检测器主要有紫外检测器、荧光检测器等。 

　　1.紫外检测器 

　　使用紫外检测器时要注意环境因素带来的干扰由于静电的作用，检测器在使用时易于从周围环境中吸附尘埃，覆盖在光学元件上的尘埃能降低光的传播效率，加大了光的散射，对检测有影响。故紫外检测器周围的环境要清洁，经常打扫，保持干净。强紫外照射还会使一些光学材料涂层降解，慢慢增加噪声，故检测器应避免阳光直射。长时间不用检测器时，应定期冲洗流路赶走池内产生的气泡。 

　　2.荧光检测器的使用与维护 

　　荧光检测器的灵敏度比紫外检测器高，特别适用于痕量组分检测。日常使用中应注意以下几点： 

　　2.1不能使用抑制或吸收荧光的溶剂作流动相仁。 

　　2.2溶剂的极性和溶液的温度对荧光强度有明显的影响。增大溶剂的极性，导致荧光增强。通常荧光物质溶液的荧光效率和荧光强度，随着温度的升高而降低，液相色谱中，荧光检测器通常在室温下操作，可以保证足够的灵敏度。 

　　2.3当样品浓度过高时，荧光物质分子易与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起溶液的荧光强度降低，荧光强度不再与浓度呈线性关系，即荧光淬灭效应。因此，在进行荧光检测时，试样要配成低于10-6g/mL浓度的溶液，要使用不含荧光物质的溶剂。 

　　液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于生物医药研究、环境监测和食品检测等领域。我们在工作中，为保证分析结果的科学性和准确性，必须重视和加强对液相色谱仪的管理和维护。只有良好规范的管理，才能使仪器处于*工作状态，保证各项分析工作顺利完成，得出的实验数据真实可靠。